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上期回顾：细胞粘附动力学分析之细胞膜延伸表征的重要性
小伙伴们，可爱又聪明的小编又来给大家补充精神食粮了。今天，我们学习一种非常实用的分析技巧——末端限制性片段分析。
本实验的总体目标是确定真核细胞的端粒长度，该实验运用了改良版的末端限制性片段分析法。
首先了解一下本期的主要研究对象——端粒
端粒（英文名：Telomere）是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。端粒其长度反映细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。
末端限制性片段分析的意义：该方法通过提供端粒连接的数据，解决细胞生物学行为医学、流行病学、传染病学的问题，揭示了年龄、压力、药物治疗和感染在这些领域的影响。
（一）基因组DNA消化
操作过程：
1.从细胞中提取出的基因组DNA样品，按照DNA提取试剂使用说明，在操作开始阶段准备0.6%琼脂糖溶液，在20~40微升的终体积中消化基因组DNA。
2.在微量离心管中混合一下试剂：3微升的基因组DNA，10xDNA消化缓冲液，1微升RsaI限制酶，1微升HinfI限制酶，使用无菌、去离子水调至终体积。
3.短暂离心以保证所有组分都在离心管底部，然后在37℃下孵育消化物至少16小时。
（二）基因组DNA凝胶电泳
操作过程：
1.在操作开始阶段准备0.6%琼脂糖溶液，制备凝胶电泳系统进行电泳跑胶。
2.连接筒状浇口和凝胶浇铸盘，当琼脂糖凝胶溶液冷却至50℃时，将之倒入凝胶浇铸盘，插入电泳梳子，在室温下等待45分钟至胶体凝固。
3.将筒状浇口从凝胶浇铸盘上取下，将电泳梳子从胶板上取下，向电泳凝胶系统注入电泳缓冲液，至装填饱和线以确保凝胶完全浸没在缓冲液里。
4.将DNA样品注入凝胶的小孔中，样品之间留一个空孔为分割。加10微升的DNA梯子至凝胶另一端的孔中。
5.在V电压下跑胶30分钟使DNA进入凝胶，30分钟后调节电压至57V，再跑18~24小时。
（三）凝胶荧光成像与杂交
操作过程：
1.在18~24小时的跑胶后，关闭电泳电源并从电泳缓冲液中取出带着凝胶的凝胶浇铸盘。
2.切除凝胶的右上角作为定位标记。剪一块略大于凝胶的滤纸。将滤纸盖在置于浇铸盘的凝胶上。让滤纸吸收凝胶上多余的液体，用移液管滚动，从凝胶边缘小心赶出凝胶与保鲜膜之间的气泡。
3.将凝胶与滤纸一起翻转，从浇铸盘上取下凝胶，从滤纸上将凝胶转移至干胶器并用保鲜膜包住凝胶。用移液管滚动，小心赶出凝胶与保鲜膜之间的气泡，然后在50℃下干燥凝胶2小时。
4.当凝胶干燥后去除其上保鲜膜并将凝胶和滤纸一并转移至盛有ml去离子水的玻璃皿中。小心撕去滤纸，在室温下培育凝胶15分钟。
5.把凝胶放置在12×12英尺的尼龙网上。将尼龙网和凝胶卷在一起，放入杂交管中。混合ml的5xsSSC溶液（mM氯化钠+75mM柠檬酸钠）和12微升的绿色荧光核酸染色，将混合液注入杂交管中，在42℃的杂交烘箱中旋转培育30分钟。
6.30分钟后，从杂交管中取出尼龙网和凝胶，放置在盛有ml去离子水的玻璃皿中，并且去掉尼龙网，最后使用荧光粉成像仪使凝胶显像。
（四）端粒探针杂交
操作过程：
1.遵循放射性物质管理办法准备放射性端粒探针。在微量离心管中混合下列试剂：2微升的端粒探针，2.5微升的10x多核苷酸激酶反应缓冲液，3微升的γ32P-dATP，4微升的T4多核苷酸激酶，用无脱氧核糖核酸酶的无菌去离子水定容至20微升，然后进行简单离心。
2.在37℃水浴中培育1小时后再次进行离心，并在65℃下培育20分钟使反应停止。
3.将放射性探针溶液装入预先准备好的G-25色谱柱中，xg离心2分钟。保留含有放射性端粒探针的上清液
4.将凝胶放入盛有ml变性溶液的玻璃皿中，室温里培育15分钟。倒去变性溶液，更换为ml无菌去离子水，然后在室温下在定轨振荡器培育凝胶10分钟。
5.10分钟后倒去去离子水，更换为ml中和溶液，继续在室温下培育15分钟。
6.将凝胶卷入尼龙网中，一并放入杂交管。加入20ml杂交溶液，在42°C的杂交烘箱中旋转孵育10min。随后倒去杂交溶液，更换为20ml新鲜杂交溶液。
7.最后加入所有端粒探针，在42°C的杂交烘箱中旋转孵育过夜。
（五）凝胶洗涤，荧光屏曝光和无线电成像
1.当端粒探针杂交完成后，从杂交管中取出凝胶和尼龙网，放入盛有ml2xSSC溶液的玻璃皿中。在玻璃皿上展平凝胶卷并取下尼龙网，将玻璃皿放在定轨振荡器上室温里培育15分钟。
2.倒去2xSSC溶液。更换为ml0.1xSSC溶液和0.1%SDS（十二烷基硫酸钠）溶液，
室温里在定轨振荡器上培育凝胶15分钟。
3.然后倒去0.1xSSC溶液和0.1%SDS溶液，更换为ml2xSSC溶液，在定轨振荡器上室温再培育15分钟。
4.从2xSSC溶液中取出凝胶，并用保鲜膜包住凝胶，赶平凝胶与保鲜膜之间的气泡和气窝，将凝胶放入带有荧光屏的曝光盒并暴露在荧光屏下保存过夜。次日，用荧光粉成像仪使曝光的荧光屏显像。
端粒限制性片段分析结果：末端限制性片段分析法可以测量端粒长度
从端粒酶永生化人包皮成纤维细胞和人外周血单核细胞中分离出的三种浓度的DNA，可用于分析测量端粒长度。用绿色荧光核酸染色的干燥琼脂糖凝胶荧光图像上1号泳道和8号泳道有DNA梯形条带。
图1：绿色荧光核酸染色凝胶。
从凝胶顶部到条带的距离所对应的分子质量标准用蓝色箭头标出。端粒探针杂交后，端粒条带在各泳道中展现为涂片形式，计算每个泳道以及一个背景泳道中的盒网格。
图2：标记带迁移距离的确定。
端粒探针杂交后，端粒条带在各泳道中展现为涂片形式。每组样品间隔一个标记为B的泳道，以确保各组的背景强度相似。
图3：用端粒探针探测DNA样本的磷光。
平均端粒长度计算揭示了端粒酶永生化人包皮成纤维细胞较人外周血单核细胞拥有更长的平均端粒长度。
这些结果同时也说明了各泳道中基因组DNA含量对杂交后检测信号的强弱至关重要。
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