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上期回顾：多重免疫荧光分析
早上好，小伙伴们，今天小编继续为大家带来最前沿最科学的实验技术。本期实验的总目标是将报告基因稳定地引入人源肿瘤异种移植模型PDX中，促进其应用和自发肿瘤转移模型的建立。
这项技术的优点：
1）对标记的PDXs，可以用体内成像进行追踪；
2）有助于对器官特异性转移的评估，而且不用进行复杂的非活体组织学分析；
3）这个方法有助于解决肿瘤学领域的关键问题，比如异种移植实验性肿瘤的转移程度。
（一）人源肿瘤异种移植模型肿瘤细胞的解剖与分选
实验步骤：
1.首先，用手术刀切割肿瘤周围皮肤，用镊子拉住皮肤，用干净的手术刀将皮肤和肿瘤分开。当肿瘤完全暴露时，使用一套干净的镊子和手术刀，冰浴条件下将组织转移到5毫升洗涤介质中。
2.然后除去洗涤介质，并使用10毫升含有hepes的hbss清洗肿瘤两次。将冲洗好的肿瘤放入预先称量好的60厘米无菌组织培养基中，再进行称量计算肿瘤质量。用手术刀，将肿瘤切成两半。在其中一半上切下一个三毫米的圆盘状。之后将其放入20%福尔马林中24小时。
3.加入微升含有hepes的hbss于剩余的肿瘤组织中，用镊子和干净的手术刀将组织切成尽可能小的碎片。将碎片转移至50毫升无菌锥形离心管中，并每毫克肿瘤组织，加入至少1毫升消化缓冲液，其中含有1x抗菌-抗真菌剂。
4.在30摄氏度，到转每分钟的条件下消化3小时，加入35毫升洗涤介质终止消化。使用70微米尼龙网过滤所得肿瘤组织液，并转移到50毫升锥形离心管中，除去未消化的组织。通过离心收集细胞，并且重悬沉淀。室温条件下置于在1毫升红细胞裂解缓冲液中5分钟。
5.裂解结束时，用10毫升洗涤缓冲液使细胞恢复张力，并通过40微米过滤器过滤细胞，除去所有团块。然后再次对细胞进行离心，将沉淀物重悬于5毫升洗涤缓冲液中，并置于冰上。之后通过台盼蓝拒染法进行细胞计数。
（二）人上皮癌细胞的富集
实验步骤：
1.为了富集人上皮癌细胞，使用lineage+小鼠细胞分选试剂盒。将1x10^7个细胞转移到5毫升聚丙烯管中，再加入2毫升上皮细胞富集缓冲液。
2.离心收集细胞，并使用移液管完全除去上清液。将沉淀重悬于40微升冰冷的上皮细胞富集缓冲液中。每1x10^7细胞中再加入10微升生物素抗体混合物。轻轻吹打混匀，将细胞溶液在4摄氏度下孵育10分钟。
3.孵育完毕后，每1x10^7个细胞加入30微升，上皮细胞富集缓冲液并混合。随后加入20微升抗生物素微球并温和混匀。4摄氏度下15分钟后，用3毫升冷上皮细胞富集缓冲液冲洗细胞，并小心吸出上清液。
4.冰浴条件下将细胞沉淀重悬于微升上皮细胞富集缓冲液中。在磁性分离器上放上一根色谱柱，用0.5毫升上皮细胞富集缓冲液冲洗柱子，并在柱下放置一个新的聚丙烯收集管。缓慢将标记的细胞加入柱子中，收集流出的富集的未标记的lineage阴性的肿瘤细胞。之后，用毫升新鲜的上皮细胞富集缓冲液冲洗柱子3次。
（三）PDX来源的肿瘤细胞的转导，转导效率评估以及肿瘤细胞的再植入
细胞转导操作过程：
1.将分离的细胞离心并用2毫升微球体细胞培养基重悬。计数后，再次将细胞离心，并用2毫升微球体细胞培养基重悬，其中含有20微升聚凝胺。
2.之后，以每孔2x10^5个活肿瘤细胞，加入超低黏附6孔细胞组织培养板中。将慢病毒颗粒加入细胞中，感染复数为10。将培养板震荡混匀病毒和细胞。
3.然后在37摄氏度，5%CO2细胞培养箱中共培养96小时。24小时后，加入50微升新鲜微球体培养基。当至少10%的细胞为gfp阳性时，将至少一孔转导细胞在冰浴条件下转移到15毫升离心管中。并用1毫升微球体培养基清洗孔板，然后将洗涤液转移到细胞中。将肿瘤细胞于10毫升含有hepes的hbss溶液中离心。
4.最后，在冰浴条件下重悬细胞于50毫升基质胶中，并将嵌入基质胶的细胞装入0.5毫升胰岛素注器中用于再植入。
实验结果：使用高滴度慢病毒载体进行PDX相关乳腺癌细胞转导
一些高滴度病毒载体可以表达荧光标记，能够在转染24小时后，估计其体外转导效率。
对于大部分PDXS，gfp表达会被延迟至72小时以后。这时，通常可以观察到细胞聚集体的形成。
被标记的肿瘤细胞再生成肿瘤可以通过生物荧光或者荧光标记进行观察追踪。一个成功标记的pdx近乎%为gfp阳性，在转导后第一代，并且在接下来的传代中也保持如此。但是一些PDX表现出gfp阳性细胞斑块状分布。这种情况为次优的体外转导。
肿瘤细胞免疫组化染色显示，一些关键的标志物，如表皮生长因子受体和泛细胞角蛋白，即使经过几次传代和再植入，依然为保守表达。
实验转移模型提供了另一种研究转移级联反应中器官亲和性和器官移植步骤的方法。每只小鼠注射2.5x10^5个pdx转导细胞，在肝脏内形成转移。其可通过体外荧光素酶成像来确认。并且在肺中，可以通过荧光显微镜离体观察。
*NOTE：当检测该实验时，使用具有报告基因的高滴度病毒很重要。同时对转移效率和肿瘤生长情况需进行体外监测。根据上述实验步骤，也可以进行体内转移的研究。
以上的实验操作可以更好地理解如何用高滴度慢病毒颗粒标记相关肿瘤细胞，并对体内对肿瘤细胞进行追踪，同时还可以操控靶向基因的表达。
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