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上期回顾：人源肿瘤异种移植模型
斑马鱼是一个强大的研究人类恶性肿瘤的模型。它与哺乳动物的生理和遗传相似性很高，与临床环境密切相关，并能监测肿瘤的自然病史。透明胚胎显示出明显的特征，有助于肿瘤的发生发展、血管生成、侵袭和转移。
本期实验的总体目标是评估斑马鱼胚胎模型中癌细胞的恶性程度和侵入行为。这种方法有助于研究人员判断癌细胞是否能从功能系统侵入到循环系统，从而对转移级联的关键步骤进行建模。
这种技术的主要优点是斑马鱼胚胎模型提供了一种较短的评估周转时间，比在小鼠身上进行的类似实验时间更短。
（一）斑马鱼胚胎心前区窦癌细胞注射
操作步骤：
1.根据制备指南制备好癌细胞，试剂，和斑马鱼胚胎后，将微注射分配系统连接到压缩空气源上，并打开电源。踩下脚踏板来测试压力，针筒应该发出一段空气脉冲。在注射盘中加入20毫升的2xTricaine溶液。然后放在振荡器上摇匀，用第二等份的2Tricaine溶液重复平衡。
2.使用塑胶吸管将一组胚胎转移到含有2xTricaine溶液的小皿中，使用凝胶加样针头，将癌细胞充填至微注射针中。将针放在电极存储罐中，尖端朝下，使细胞靠近尖端。利用移液管里的2xtricaine溶液，将20至30个麻醉胚胎转移到注射盘上。让胚胎停留在移液管的尖端。然后轻轻地将胚胎注入注射盘的槽内，使胚胎沿着凹槽展开。将胚胎头部朝上对齐，腹部朝向槽壁，将针固定在微机械臂的针筒上。
3.将注射板置于左壁为60度的立体镜下方，25倍放大后聚焦在顶端的胚胎。调整微机械臂的位置，这样当其伸展时，针将刺破胚胎。然后用肉眼观察，直到针头接近胚胎。此时，同时在显微镜下观察，将针头对准胚胎。通过卵黄囊刺穿胚胎，将癌细胞注入胚胎。踩脚踏板，将针尖放在心前静脉窦上，但不要插入。注射的推力会使细胞进入心脏窦。或者，将细胞注射到卵黄囊中，就可以研究癌细胞入侵血管能力。
4.当完成所有胚胎的注射，将针放回电极储存瓶。将胚胎转移到复原培养皿中，倾斜注射平板将胚胎移到底部。将胚胎从水槽中冲洗出来，用塑胶吸管收集它们。使胚胎在移液管底部沉淀，然后以最少量的Tricaine试剂将胚胎转移到复原培养皿中。在28摄氏度的培养皿中孵育胚胎一个小时，然后将存活的胚胎与死亡的胚胎和碎片分离，在33摄氏度下继续孵育，直到开始评分。
（二）溢出物评分
麻醉后，根据文本协议对胚胎进行评分。将麻醉后的虫卵放在显微镜载玻片上，并滴上一滴tricaine溶液。侧放幼虫以获得尾部区域的最佳成像视野，将载玻片放在带有10倍物镜的复合荧光显微镜下，对幼虫进行评分。通过对成功侵入血管的癌细胞计数，同时在尾部区域上下聚焦，来清晰地分辨出完整的细胞。
（三）胚胎切片以及后续荧光成像
操作步骤：
1.融化1.5％的琼脂糖/三卡因溶液，并保存在37摄氏度下。在胚胎麻醉后，将一滴tricaine液中的一个胚胎转移到成像面。用玻璃吸管吸去多余的tricaine溶液，在成像面上保留胚胎。
2.在胚胎上覆盖一滴融化的琼脂糖溶液，在琼脂糖凝固前，快速使用像睫毛刷这类的精致工具，将胚胎横向定位以成像，特别注意的是要确保胚胎沿在成像表面被压平。当琼脂糖凝固时，把它浸入tricaine溶液中。最后，将斑马鱼胚胎进行显微成像。
结果：斑马鱼胚胎癌细胞血管侵袭
在斑马鱼胚胎中检测7个乳腺癌细胞系的血管侵袭能力。在注射96小时后进行评估，发现MDA-MB-细胞系在每个胚胎都显示出了最多的外渗癌细胞数量。
从上图可以观察到BT-细胞容易侵入胚胎的尾部区域。而其他细胞系如MCF-7，SK-BR-3和T-47D细胞则极少出现入侵尾部的情况。
另一种改进的试验是在不同的部位进行癌细胞注射。在竞争性实验中，将两种不同血管侵袭能力的MDA-MB-细胞群同时注射到发育中的胚胎卵黄囊中。评分时，据测定，MDA-MB-细胞融合的文化传播条件下注射前，发现细胞数量在进入血液循环过程中减少因此，胚胎尾部区域的细胞数量减少。
以上就是本期的主要内容，具体的实验操作过程请观看下方视频哦~
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