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上期回顾：抗癌新方法：光动力让癌症治疗少走弯路
肿瘤乏氧，亦即肿瘤供氧不足，在实体瘤中是一个非常常见的现象。肿瘤乏氧细胞在新陈代谢、分子遗传学及病理生理方面发生改变，从而在肿瘤演化进展过程中起着非常重要的作用，并对放化疗抗拒导致肿瘤局部复发、远处转移和预后不良。因此，对肿瘤细胞乏氧的研究仍是一个非常热门的课题。
实体肿瘤内部乏氧区域分布
本期实验的总目标是用动物模型直接检测肿瘤乏氧对肿瘤转移的影响。在此模型中，通过结扎股动脉、向小鼠肿瘤门静脉供血形成人工肿瘤，随后对小鼠大腿进行截肢预防原发肿瘤的快速生长以形成转移。
这个方法有助于理解低氧的促转移作用对潜在的新治疗靶点的效果,以阻止肿瘤转移的机制。这项技术的两个优点是能够检测体内肿瘤缺氧的影响以及总结出转移过程和细胞在癌症患者中发生的相互作用。
（一）原位注射尤文肉瘤（EV）细胞并通过股动脉结扎（FAL）诱导缺氧
操作步骤：
1.为了注射尤文肿瘤细胞，轻轻按压住4-6周的雌性米色小鼠，以30-45°的角度插入一个28码1/2英寸的针进入腓肠肌至胫骨嵴。当针尖触碰到脊的时候，轻轻的把针拔出一些缓慢注入0.1毫升尤文肉瘤细胞然后继续把针拔出来。
2.每日测量小鼠腿内外侧的大小直到肿瘤的大小达到要求。在进行结扎之前，先皮下注射止痛剂，然后确认是否缺氧。然后用脱毛膏把手术区给麻醉的小鼠进行脱毛，10分钟后用酒精棉除去脱毛膏，对暴露的皮肤用10%聚维酮碘和乙醇擦拭消毒连续三次。
3.在立体显微镜下观察小鼠，从大腿中部到腹股沟区做一个1厘米的切口。用盐水浸湿的细棉签轻轻擦去大腿肌肉周围的皮下脂肪组织。然后仔细地解剖皮下脂肪组织暴露出股底动脉。固定住伤口和手术区，暴露出中上部收肌血管，并用细镊子轻轻刺穿膜性股鞘暴露出神经血管束。
4.用一套干净的细钳分离解剖股动脉、股静脉和神经，在靠近腹股沟附近和腹股沟韧带远端的位置进行。然后在股动脉下穿过6-O丝线缝合旋股外侧动脉远支和阻断股动脉双结。用6-O聚丙烯缝线闭合切口皮下注射0.5毫升温盐水进行体液平衡治疗。然后把动物放在回收笼里的暖垫上，直到它完全康复。
（二）通过截肢对原发性肿瘤进行切除
1.在适当的实验时间点，轻轻的按住小鼠，用剪刀刮去从胫骨远端到骨盆区域的有瘤肢体的毛发。注射止痛剂并将麻醉小鼠放右侧卧位、无菌的褶皱暖垫上。
2.在小鼠眼睛上涂抹油膏，并对手术部位进行消毒然后用消毒布盖住小鼠，对股骨中段皮肤进行环切。用钝器把近端皮肤剥离并将近端皮肤收回，在小腿内侧暴露出股内侧神经血管蒂。
3.然后用有4-O多聚半乳糖结合蛋白涂层的可吸收缝线来结扎近腹股沟韧带。用剪刀将股骨中段肌肉切断，其次是对髋股关节软组织进行钝性分离。用骨钳对股骨中段进行截断，然后用吸收性明胶海绵在截骨处轻轻按压以减少出血，用外科创伤夹将表面的皮肤夹住，并且皮下注射0.5毫升温盐水进行体液平衡治疗。
（三）转移监测与原代肿瘤细胞培养
1.至少一周两次对肿瘤注射小鼠的头部、颈部、腋窝以及侧后肢进行仔细触诊。通过腹胀检查内部器官是否转移，通过用食指轻柔按压看是否存在肺转移。
2.在恰当的实验时间点，利用磁共振成像技术（MRI）来评估内部器官是否转移，打开连接到温水循环系统的泵让小鼠保持在生理体温的条件下，然后打开BIOPAC系统呼吸监测设备，将麻醉小鼠固定在专门定制的小鼠立体定位架上并用油膏将小鼠眼睛涂上。为了减少运动伪影和噪声同步收集数据和呼吸周期，可选择MRI方法中的门控选项。运行一个二维T2加权解剖成像序列来显示肿瘤的转移。
3.截肢后对原发性肿瘤细胞进行培养，通过手术或解剖获取2-3个，2-3毫米大小的湿红色有光泽的粉红色肿瘤组织。从每个目的组织样本中分离出的细胞，放在六厘米大小的细胞培养板中培养，然后将组织转移到细胞培养箱中以适当的细胞生长期进行增殖。
结果：FAL对原代肿瘤细胞的典型影响
将尤文肉瘤细注射到腓肠肌内，使原发肿瘤生长到立方毫米大小的腓肠肌。这种体积下的对照组肿瘤表现出相对低水平的内源性缺氧。这只出现于用缺氧探针1染色法所确定的远离脉管系统的细胞中。相反的是，股动脉结扎引起绝大多数肿瘤细胞的极度缺氧，甚至是那些靠近血管的细胞。
原发肿瘤的生长完全被抑制，这证实了股动脉结扎的有效性，这在股动脉结扎和截肢之间的三天内都是有效的。
组织病理学分析显示，术后三天，股动脉结扎治疗原发性肿瘤坏死区明显扩大。尽管如此，肿瘤组织内仍有一群活的细胞存在，它们位于肿瘤边缘，靠近脉管系统的位置。
它们大规模入侵血管证明了这些剩余的肿瘤细胞具有高度的侵袭性。血管腔内的许多细胞表现为缺氧探针阳性，表明股动脉结扎后缺氧的细胞可能会引起侵袭血管。
在这些实验中，缺氧显著增加了转移的频率和多样性在小鼠对照组肿瘤中，观察部位经常是没有影响的。
*NOTE:整个实验的长度取决于所使用的细胞系以及细胞生长和转移速率。磁共振成像和安乐死时间轴根据转移的潜伏期而异并且必须为每个单独的细胞系建立一个中间试验。
这项技术可以用来直接检测肿瘤缺氧对疾病传播的影响,同时可以帮助理解如何建立一个肿瘤缺氧的动物模型以及如何在体内和体外监测肿瘤转移。
以上就是本期的主要内容，具体的实验操作过程请观看下方视频哦~